Aditivos Funcionales para Piensos

Los aditivos funcionales para piensos pueden reducir el impacto de una infección de Enteromy xumleei en el rendimiento y la gravedad de la enfermedad: evidencia de un desafío experimental con dorada

Internacional: La preocupación por el impacto de las infecciones parasitarias en la acuicultura ha aumentado en los últimos años. Además de los episodios de mortalidad visible y el aumento de los costos de funcionamiento, las estimaciones de la pérdida anual de crecimiento en las granjas acuícolas por parásitos oscilan entre el 1 y el 10 % de la cosecha, con un costo anual que puede llegar a US $ 9,58 mil millones. Shinn et al., 2015).

En la acuicultura mediterránea, una de las principales enfermedades parasitarias es la enteromixosis, causada por Enteromyxumleei (Figura 1). Este parásito microscópico infecta el tracto intestinal de los peces y órganos a veces asociados como la vesícula biliar y el hígado. Las especies de Enteromyxum pertenecen a los Myxozoa, un grupo de parásitos relacionados con Cnidarians que producen enfermedades de peces económicamente importantes como la enfermedad giratoria, enfermedad renal proliferativa (PKD), licuefacción láctea de los peces, enfermedad de las branquias proliferativas (PGD), sphaerosporosis branquial ) O la ceratomixosis.

En contraste con los dos ciclo de vidas del huésped descrito para alrededor de 50 especies de myxozoan, la transmisión espontánea directa de peces a peces se ha demostrado para el género Enteromyxum. Este único modo de transmisión horizontal favorece la propagación de enteromixosas en poblaciones de peces de cultivo.

El E. leei tiene un amplio rango de hospedaje y distribución geográfica, incluyendo especies acuícolas económicamente importantes en el Mediterráneo y en todo el mundo, como el pez globo, la platija japonesa, el lorito, el mero malabar, los distintos dorados o la platija fina peruana. La virulencia y la mortalidad causada en cada huésped es bastante variable, y en gran medida afectada por la susceptibilidad de las especies, el sistema de cría y las condiciones ambientales.

En la dorada dorada (GSB) (Sparusaurata), la enteromixosis tiene un curso crónico que conduce a un síndrome caquéctico con anorexia, anemia, pérdida de peso, atrofia severa del músculo epaxial y, finalmente, muerte (Sitjà-Bobadilla y Palenzuela, 2012). 1). La mortalidad directa debido a la enteromixosis en GSB criados en jaulas marinas es a menudo moderada, mientras que el grave impacto económico de la enteromixosis en estas instalaciones se debe en gran medida al pobre crecimiento ya la imposibilidad de alcanzar el tamaño comercial. Este efecto se ve más en las etapas avanzadas del período de crecimiento.

No existen vacunas ni medicamentos eficaces para la enteromixosis y sus medidas de control se limitan a evitar factores de riesgo, diagnóstico precoz y buenas prácticas de manejo. Por lo tanto, la industria acuícola necesita otras soluciones para minimizar el impacto de la infección. Los aditivos para piensos que promueven la salud, son un componente crucial en la prevención de enfermedades. Actualmente se ofrece una amplia gama de aditivos con diferentes modos de acción incluyendo extractos de levadura, fitobióticos, probióticos, prebióticos, ácidos orgánicos y sus derivados.

Los alimentos funcionales que contienen promotores de la salud intestinal entregan con cada comida una concentración adecuada de compuestos naturales, que pueden funcionar a través de múltiples mecanismos para reducir el éxito de las infestaciones parasitarias. Los compuestos naturales con actividad antiparasitaria pueden trabajar directamente sobre los parásitos intestinales y / o llegar a la sangre y / o moco para afectar a los ectoparásitos, mientras que los moduladores inmunes pueden cambiar la composición y el grosor del moco (Coutteau et al., 2011, 2014, 2016 ).

Muchas de estas estrategias apuntan al intestino como un foco primario para la salud y ofrecen los máximos beneficios en procesos de infección crónica o subcrónica, por lo que la enteromixosis GSB constituye un excelente modelo para estudiar y evaluar su potencial. El presente estudio evaluó la capacidad de un aditivo alimentario funcional para prevenir o mitigar el efecto de la enteromixosis en la dorada dorada, experimentalmente infectada con E. leei. Todos los experimentos se realizaron en las instalaciones experimentales interiores del Instituto de Acuicultura Torre de la Sal (IATS) utilizando tanques de fibra de vidrio en un sistema de agua de mar de flujo abierto.

Piensos y protocolo de alimentación

Los alevines GSB naïve, libres de parásitos intestinales se obtuvieron de un criadero local a cuatro gramos y crecieron hasta 12,9 g antes de iniciar el ensayo de alimentación. Se asignaron a tanques de 90 l (25 peces / tanque) y se aclimataron a la dieta basal durante 11 días hasta que comenzó la alimentación experimental. Se ensayaron tres dietas en dos tanques de repetición / tratamiento: un alimento de control basal (Dieta A) y la misma dieta con dos niveles diferentes de inclusión de SANACORE® GM, un aditivo natural para promover la salud (Nutriad International, Bélgica); Dieta B “baja dosificación” y dieta C ” alta dosificación” de SANACORE® GM.

La dieta basal fue representativa de una formulación de alimento comercial (45/20% de proteína cruda / grasa, 15% de harina de pescado LT, 12% de harina de soja, harina de soja 25%, concentrado de proteína de soja 10%, gluten de maíz 8% Gluten 3,4%, harina de trigo 10,5%, aceite de soja 9,7%, aceite de pescado 6%, aminoácidos y premezclade vitaminas y minerales).

Los peces se alimentaron manualmente ad libitum dos veces al día durante la semana y con alimentadores automáticos durante los fines de semana, durante todo el experimento. Se registró la ingesta diaria de alimentos y se calculó SGR (tasa de crecimiento específico) y FCR (conversión alimenticia). La temperatura del agua varió de 18 a 26,5 ° C durante el ensayo de alimentación (después del período de estimulación entre 22ºC y 26,5ºC, véase la figura 2A). La salinidad del agua de mar fue de 37,5 g / l.

Infección experimental y muestreo

Después de cinco semanas con las dietas experimentales, los peces de los grupos A, B y C se inocularon con 0,2 ml de un homogeneizado de raspados intestinales de peces donantes infectados a través de la vía anal, como se describió anteriormente (Estensoro et al., 2010).

Un grupo adicional de peces alimentados con la dieta basal A recibieron el mismo volumen de PBS sin parásitos (grupo de control ni desafiado CTRL). Una prueba de PCR no letal de desafío se llevó a cabo a las cinco semanas después de la inoculación (p.i.), para comprobar el progreso de la infección después del desafío. El muestreo final de todos los grupos se realizó 10 semanas p.i, cuando se sacrificaron todos los peces y se tomaron muestras intestinales para el diagnóstico de E. leei por histología (n = 16-20 / grupo) y qPRC (n = 29-30 / grupo). Dado que el estudio parasitológico por cualquiera de los métodos consumió toda la muestra, los peces analizados por histología fueron diferentes de los utilizados para el diagnóstico molecular.

Diagnóstico de la Infeción

Histología: Se fijaron porciones de muestras intestinales anteriores (AI), medianas (MI) y posteriores (PI) en formalina tamponada al 10 por ciento y embebidas en resina plástica, siguiendo procedimientos rutinarios. Las láminas seccionadas se tiñeron con Giemsa y la intensidad de la infección del E. leei se evaluó semi cuantitativamente siguiendo una escala convencional de 1+ a 6+. El pez se consideró positivo para la infección cuando el parásito se encontró al menos en un segmento intestinal.

Cuantificación de parásitos por qPCR: Después de la necropsia, los intestinos enteros de 30 peces por grupo (15 por tanque) fueron removidos y pesados individualmente. Se homogeneizaron en un mezclador con perlas de acero y se extrajo ADN de una alícuota de 200 \ mu l del homogeneizado de cada uno de los peces. Las copias del gen de ADN Enteromyxumleeise estimaron por qPCR.

Los números fueron interpolados a partir de los umbrales de ciclo (Cts) de las muestras, usando curvas estándar con números conocidos de un plásmido que contiene el gen específico (que abarca 6-7 órdenes de magnitud), y se ejecuó en las mismas placas en cada ensayo. Usualmente se realizaron dos diluciones de cada muestra de ADN. Las muestras con Ct<38 se consideraron positivas. El número total de genes de ARNr de parásitos presentes en cada pez se estimó a partir de estos valores y la cantidad de tejido en toda la muestra homogeneizada.

Estadísticas

Se estudiaron los datos parasitológicos biométricos y cuantitativos en cuanto a las diferencias entre los grupos de ensayo y los controles mediante pruebas apropiadas para cada tipo de variable, utilizando los paquetes de software Sigma-Plot y Prism. Como los datos están sobre-dispersados y agregados, la carga cuantitativa de parásitos estimada por qPCR se normalizó mediante transformación logarítmica (y = Ln (y) para los datos de intensidad, ey = Ln (1 + y) para los datos de abundancia). A menos que se indique específicamente, significancia estadística se consideró cuando P <0,05.

Resultados & Discusión

Ingesta de alimento y rendimiento de crecimiento:

Los peces desafiados con el parásito sufrieron una disminución en la ingesta de alimentos, lo que se notaba en una semana p.i. En el Grupo A, y continuó disminuyendo a lo largo de todo el período comparado con el Grupo de control no desafiado (Figura 2A). Por el contrario, la anorexia comenzó más tarde (3 semanas p.i.) en los peces alimentados con la dieta B y no se notó en los peces que recibieron la dieta C con la dosis aditiva más alta, que mantuvo una ingesta similar a la del pescado control. Así, la anorexia típica inducida por el parásito (Estensoro et al., 2011) parecía superarse en gran parte con una dosis más alta del aditivo.

El efecto del desafío del parásito sobre los valores biométricos fue bastante patente, particularmente en el último muestreo a las 10 semanas p.i. (Figura 2B, 2D). El peso, la longitud y el factor de condición (CF) se redujeron significativamente en los peces que recibieron la dieta basal (A), en comparación con el grupo de control no desafiado con la misma dieta (CTRL). Curiosamente, en los peces que recibieron las dietas suplementadas se redujo la duración y la pérdida de peso asociadas a la infección, y las diferencias sólo alcanzaron significación estadística en el grupo de dosis más baja (B).

El Grupo C no fue significativamente diferente a CTRL en parámetros biométricos, y la CF no se redujo significativamente en ambos grupos tratados (Figura 2B y los datos no presentados). Como se esperaba, el SGR a lo largo de todo el ensayo disminuyó en todos los grupos desafiados, pero la disminución frente a los peces CTRL fue mitigado en la dieta C (10,2%), mientras que alcanzó 21,1% y 25,9% en las dietas B y A respectivamente (Figura 2D ). En general, la evolución de los datos biométricos evidenció claramente el efecto clínico de la infección en los grupos afectados, en consonancia con los estudios de campo sobre las poblaciones infectadas con E. leei y con los resultados de estudios previos de laboratorio con este parásito.

Se cree que la disminución del rendimiento de los peces infectados con E. leei es el resultado de un efecto combinado de daño estructural directo al intestino que resulta en una pobre absorción de nutrientes y deshidratación, en la desviación de energía invertida en el montaje de una respuesta inmune y también a la anorexia desencadenada por el proceso infeccioso (Sitjà-Bobadilla &Palenzuela, 2012).

Como se deduce de los resultados de este ensayo, las dietas suplementadas podrían revertir parcialmente estos efectos y alcanzar niveles de rendimiento similares a CTRL en el grupo de dosis alta.

Supervivencia:

La reducción de la mortalidad se detectó en los grupos desafiados a partir de 16 días p.i. Un total de 14 peces murieron. No se encontraron diferencias significativas entre las dietas en las curvas de supervivencia, pero la mortalidad acumulada máxima se registró en el grupo A (20%). Ambos grupos B y C suplementados alcanzaron el mismo valor acumulativo de mortalidad (13,3%).

Datos parasitológicos:

No se encontraron peces infectados en el grupo CTRL y no hubo diferencias significativas en las variables medidas entre las repeticiones dentro de cada grupo. Se encontró que el 50% de los peces del grupo A desafiado (alimentado con la dieta basal) era positivo para E. leei en el muestreo no letal llevado a cabo a las cinco semanas p.i., lo que indicaba el éxito y la progresión adecuada del desafí

Según el diagnóstico molecular de qPCR, la prevalencia de infección al final del experimento fue claramente mayor en el grupo A (72,4%) que en los grupos suplementados con aditivos (B = 44,8%, C = 46,6%).

Debido al número limitado de tanques de replicación, estas diferencias no alcanzaron una gran significación estadística (Figura 3A). Sin embargo, la reducción de la prevalencia de infección en los grupos tratados vs no tratados fue significativa (t-test, P = 0,0236), al agrupar los datos de todos los tanques B y C tratados (n = 4) en comparación con los del grupo A N = 2) (datos no mostrados).

En el ensayo actual, los datos de intensidad de infección fueron claramente más bajos en ambos grupos B (x = 12,72, Md = 11,32) y C (x = 13,33 Md = 12,65) que en el grupo A (x = 14,33, Md = 14,67) Aunque las diferencias no fueron estadísticamente significativas (Figura 3B].

La media de los datos de abundancia de parásitos toma en consideración las cantidades medias de parásitos en todos los peces del grupo, combinando datos de prevalencia e intensidad en una sola variable. Este parámetro mostró claramente las diferencias en los datos parasitológicos cuantitativos entre los grupos tratados y no tratados. Ambas dietas suplementadas dieron como resultado valores significativamente más bajos de abundancia media (x̅ (B) = 5,70; x̅ (C) = 6,22) en comparación con el grupo A (x̅ (A) = 10,38) (ANOVA P = 0,029).

La media de los datos de abundancia de parásitos de ambos grupos tratados también fue significativamente diferente de la del grupo A (x̅ (B + C) = 5,97) en una prueba t (P = 0,005). Los valores medianos de abundancia para B y C fueron 0, resultando significativamente menor que el valor del grupo sin tratar (Md (A) = 13,85) (prueba de Kruskal-Wallis P = 0,017) (Figura 3C).

Dado que los ensayos moleculares cuantitativos se llevaron a cabo en homogeneizados de todo el intestino, se realizó también un análisis histopatológico de una submuestra de peces de los grupos experimentales. Al examinar por separado los tres segmentos de intestino, se investigaron las diferencias en la extensión de las infecciones a lo largo del tracto intestinal (Figura 4).

Las prevalencias generales obtenidas por histología no son las mismas que las de qPCR no sólo porque los peces examinados por ambas técnicas son individuos diferentes, sino también por las diferentes sensibilidades metodológicas. Se encontraron diferencias significativas en la prevalencia de infección entre los grupos C (31,3%) y A (64,7%) (prueba de chi cuadrado, P = 0,05), mientras que no se encontraron diferencias en el grupo B (68,8%).

Al analizar la distribución espacial y la extensión de los parásitos, la prevalencia en el intestino posterior tuvo los valores más altos en todos los grupos desafiados, lo que corresponde a los patrones habituales conocidos de distribución de E. leei a lo largo del tracto intestinal de GSB. Sólo el grupo C mostró valores de prevalencia más bajos en los tres segmentos intestinales, y la proporción de peces con más de una porción infectada fue significativamente menor en el grupo C vs A (prueba de chi cuadrado, P <0,05), pero no en el grupo B (Figura 2). 4A). En cuanto a la intensidad media de la infección por segmento intestinal, nuevamente la dieta C mostró los valores más bajos, especialmente en el intestino anterior, aunque estas diferencias no fueron estadísticamente significativas (Figura 4B).

Conclusiones

El desafío experimental con E. leei efectivamente infectó a los peces e indujo los signos clínicos de enteromixosis en los peces alimentados con la dieta basal A, con una disminución dramática de la ingesta (32,7%), peso (36,2%) y SGR (25,9%) después de 10 semanas De la infección. El 50% de este grupo resultó positivo para el parásito en una PCR no letal en el muestreo de control intermedio en la semana cinco después de la infección y el 72,4% en el muestreo final de la semana 10. Estos son indicadores de la exposición a una alta presión de infección, magnificado por las altas temperaturas del agua durante el ensayo.

La suplementación de un aditivo para pienso funcional a la alimentación refrenó la mayoría de los signos de la enfermedad cuando se usó a la dosis más alta ensayada (dieta C), es decir, la infección experimental no tuvo un impacto significativo en la ingesta de alimento, peso o crecimiento (SGR). Un efecto de dosis fue patentado y el aditivo para piensos mitigó la reducción de SGR frente a los peces no imputados, del 25,9% con la dieta basal al 10,2% con la alimentación suplementada con dosis altas.

Los datos parasitológicos cuantitativos sobre la prevalencia, la intensidad y la abundancia, así como los estudios histopatológicos sobre la extensión de la infección confirmaron el efecto de las dietas suplementadas sobre la reducción de la tasa de infección y su gravedad. De acuerdo con los datos moleculares cuantitativos, ambos grupos que recibieron el aditivo alimentario funcional mostraron menor prevalencia e intensidad de la infección en comparación con el grupo desafiado que no recibió el aditivo alimenticio. Aunque no se observó efecto dosis del suplemento sobre la reducción de la prevalencia y la carga parasitaria utilizando el método qPCR, estas diferencias se observaron en el estudio histopatológico, con el grupo C mostrando los niveles de infección más bajos.

La inclusión de un aditivo para pienso funcional en la dieta antes de una infección experimental con E. leei, redujo el impacto de la infección sobre el rendimiento, así como la gravedad de la infección.

Autor: Palenzuela O1, Del Pozo R.1, Piazzon M.C1, Isern-Subich M.M2, Ceulemans S2, Coutteau P2, Sitjà-Bobadilla A.1 1Instituto de Acuicultura Torre de la Sal (IATS-CSIC). Castellón, España (oswaldo.palenzuela@csic.es) 2Nutriad International, Dendermonde, Bélgica (mm.isern@nutriad.com)

Fuente- foto: Aquafeed/http://www.aquafeed.co/aditivos-funcionales/