Inmunización pasiva con alimentos enriquecidos con anticuerpos recombinantes VLRB-PirAvp/PirBvp contra la infección por Vibrio parahaemolyticus en camarones Litopenaeus vannamei

Los resultados sugieren que los anticuerpos recombinados VLRB-PirAvp/PirBvp pueden ser una alternativa adecuada a los anticuerpos basados en inmunoglobulinas, como tratamiento de inmunización pasiva para la gestión eficaz de los brotes de necrosis hepatopancreática aguda (AHPND) en las granjas de camarones.

La enfermedad de la necrosis hepatopancreática aguda (AHPND), antes conocida como síndrome de mortalidad temprana, fue reconocida por primera vez como una enfermedad emergente en China en 2009. Desde entonces, se ha extendido a los países vecinos del sudeste asiático, incluyendo Vietnam (2010), Malasia (2011) y Tailandia (2012).

Los camarones afectados presentan un intestino vacío y un hepatopáncreas pálido y atrofiado, cuyo tamaño puede reducirse en más del 50%. La AHPND es capaz de causar una mortalidad de hasta el 100% en los 20-30 días siguientes a la introducción en el estanque de camarones postlarvas, provocando enormes pérdidas económicas a la industria.

Una cepa única de Vibrio parahaemlyticus es la responsable de la AHPND. Es una bacteria halófila Gram-negativa que se encuentra de forma ubicua en ambientes marinos cálidos y estuarios de todo el mundo. La cepa posee un plásmido de 63 a 70 kDa que codifica las toxinas binarias PirAvp/PirBvp, las cuales en realidad son homólogas de las toxinas PirAB, relacionadas con el Photorhabdovirus. Estas dos toxinas son secretadas por la bacteria y se asocian a la patogénesis de la enfermedad; considerándose como los principales factores de virulencia implicados en la causa de la AHPND.

Se han investigado diversos métodos para controlar la AHPND, incluida la inmunización pasiva. Este artículo presenta el informe acerca de un anticuerpo VLRB que se ha desarrollado, con capacidad para reconocer y neutralizar específicamente las toxinas binarias producidas por V. parahaemolyticus, responsables de inducir la patogénesis asociada a la AHPND en los camarones.

En el ensayo de repetición, los resultados fueron aún más marcados, el grupo alimentado con el anticuerpo PirBvp-9G10 mostró una supervivencia del 60%, en contraste con el grupo alimentado con PirAvp-7C12 o el grupo de control negativo, que evidenciaron un 3% y un 0% de supervivencia, respectivamente.

Materiales y Métodos

Construcción de plásmidos de toxinas

Se cultivaron células de Vibrio parahaemolyticus (cepa D2) en caldo de infusión de cerebro y corazón (BHI). Se extrajo el ADN de este cultivo celular bacteriano. Se amplificaron PirAvp y PirBvp utilizando los cebadores respectivos. Para comprobar la veracidad de los plásmidos PirAvp/PirBvp clonados, se secuenció cada plásmido (Solgent, Corea) y las secuencias se alinearon con la secuencia original de PirAvp/PirBvp.

Expresión y purificación de la toxina recombinante Para inducir la expresión de las proteínas PirAvp/PirBvp, se cultivaron las células BL21 que albergaban los plásmidos pet32a-PirAvp o pet28b-PirBvp durante una noche en caldo Luria-Bertani (LB) con ampicilina (LB amp) y kanamicina (LB kan), respectivamente. A continuación, las células se sometieron a tres ciclos de congelación-descongelación para romper la pared celular bacteriana y se recolectaron las fracciones solubles.

Las fracciones solubles se purificaron mediante columnas de cromatografía de afinidad. Las toxinas recombinantes purificadas también se sometieron a una prueba de Western blot para comprobar su especificidad. Una vez que se verificaron los tamaños correctos, se realizaron preparaciones a gran escala de las respectivas proteínas, las cuales se cuantificaron empleando el kit PierceTM BCA protein Assay.

Finalmente, las proteínas cuantificadas se utilizaron como antígenos en experimentos posteriores. Cribado de la información celular de VLRB La línea celular que contenía la información de ADNc de VLRB se sembró en veinte placas de 96 pocillos con 200 células/pocillo y se cultivó hasta el 100% de confluencia celular. Se tomaron los sobrenadantes que contenían los VLRB recombinantes y se analizaron mediante ELISA.

El ELISA se realizó tres veces para asegurar la especificidad de los VLRBs propios de PirAvp o PirBvp, siendo PirAvp-7C12 y PirBvp-9G10 los que mostraron los niveles más altos de especificidad, los cuales se aprovecharon posteriormente para otros experimentos. Establecimiento de una línea celular que secreta VLRBs recombinantes anti-PirAvp/ PirBvp Se recogieron las células que secretan los VLRBs recombinantes específicos de PirAvp/PirBvp, PirAvp-7C12 y PirBvp-9G10. Una vez establecida la especificidad, se prepararon los sobrenadantes a gran escala y se denominaron como anticuerpos PirAvp-7C12 y PirBvp-9G10.

“Además, la eficacia de los anticuerpos VLRB como agentes inmunogénicos para inmunizar de forma pasiva a los camarones criados en altas densidades de población, podría ayudar significativamente a la industria a combatir los brotes de AHPND.”

Prueba de desafío bacteriano

Las postlarvas de Litopenaeus vannamei se transfirieron a tres tanques de 250 L: dos grupos experimentales (con anticuerpos PirAvp7C12 y PirBvp-9G10) y un grupo de control alimentado sin anticuerpos (control negativo). Los camarones se alimentaron con el anticuerpo añadido a su dieta. Los camarones desafiados y la solución bacteriana se vertieron en un nuevo acuario que contenía 100 volúmenes de agua limpia.

El volumen final fue de 15 L, que contenía 105cfu//mL de V. parahaemolyticus. Se realizaron dos ensayos distintos para obtener los datos de mortalidad. Análisis estadístico Los datos de supervivencia se analizaron estadísticamente mediante Kaplan-Meier con la prueba de Chi-cuadrado utilizando el software GraphPad Prism v.5. Las diferencias entre grupos se consideraron significativas cuando ** p < 0,001

Resultados

De las veinte placas de 96 pocillos que se examinaron en la primera ronda de cribado ELISA, solo 19 pocillos mostraron una alta unión con PirAvp y 24 pocillos con PirBvp. Tras la tercera ronda de cribado, se seleccionó un anticuerpo de cada grupo con la mayor capacidad de unión, a saber, PirAvp-7C12 y PirBvp-9G10 (Figura 1).

Según los resultados obtenidos, el nivel de supervivencia en el primer ensayo experimental en el que los camarones se alimentaron con el anticuerpo PirBvp-9G10 fue del 26,7%, lo que fue significativamente mayor que en el grupo alimentado con el anticuerpo PirAvp-7C12 (3%) y el control negativo (6%). En el ensayo de repetición, los resultados fueron aún más marcados, el grupo alimentado con el anticuerpo PirBvp-9G10 mostró una supervivencia del 60%, en contraste con el grupo alimentado con PirAvp-7C12 o el grupo de control negativo, que evidenciaron un 3% y un 0% de supervivencia, respectivamente.

Este conjunto de datos en particular es estadísticamente significativo a p< 0,001, lo que indica el efecto protector del anticuerpo PirBvp-9G10 (Figura 2). Discusiones El desarrollo de un tratamiento seguro y eficaz para enfermedades como la AHPND ha despertado un mayor interés en los últimos años.

“El uso de antibióticos para tratar infecciones bacterianas en la acuicultura industrial cuenta con objeciones a pesar de su eficacia, debido a que da lugar a cepas de bacterias resistentes a los mismos.”

Actualmente, se considera que la vacunación es la estrategia más eficaz para controlar las infecciones en la acuicultura; sin embargo, los camarones no poseen inmunidad adquirida, la cual es necesaria para inducir una respuesta de memoria a la vacuna. La posibilidad de usar la inmunización pasiva para proteger a los camarones contra las infecciones se ha explorado con anterioridad, logrando diversos grados de éxito. Gao et al. (2016) demostraron que el polvo de yema de huevo que contenía anticuerpos contra V. harveyi y V. parahaemolyticus, administrado por vía oral al camarón blanco, Litopenaeus vannamei, era eficaz para reducir las infecciones posteriores por Vibrio.

Más concretamente, los anticuerpos mostraron un efecto inhibidor sobre ambas bacterias in vitro e in vivo. Los resultados de diversas investigaciones evidencian el potencial de utilizar un anticuerpo comestible como medio de inmunización pasiva de los camarones, con la finalidad de ayudarlos a combatir la infección. En este estudio, se desarrollaron anticuerpos VLRB que reconocen específicamente PirAvp y PirBvp, lo que podría “neutralizar” el efecto de estas toxinas de virulencia.

Aunque todavía no está claro su mecanismo exacto de acción, la presencia del plásmido (pVA1) que las codifica en todas las cepas de V. parahaemolyticus causantes de AHPND, indica que son factores causales involucrados en el proceso de la enfermedad. Se sabe que las toxinas PirAvp/PirBvp son homólogas de la toxina binaria insecticida PirAB, relacionada con Photorhabdus (Pir), que presenta actividad formadora de poros en los insectos, sugiriendo que PirAvp y PirBvp podrían funcionar de forma similar.

“Es necesario que tanto Pir A como Pir B estén presentes en las larvas de los insectos para inducir la mortalidad. Dado que estas toxinas binarias se han descubierto juntas en V. parahaemolyticus, parece razonable que ambas sean también esenciales para la aparición de los síntomas asociados a la AHPND.”

Importantes estudios demostraron el papel potencial de los VLRB en la neutralización de ciertos virus, como el virus de la gripe aviar H9N2, el virus de la septicemia hemorrágica viral y el virus de la necrosis nerviosa, y los resultados son lo suficientemente convincentes como para promover su uso como agente terapéutico contra las infecciones bacterianas y virales.

En este trabajo, el alto nivel de supervivencia en el grupo alimentado con el anticuerpo PirBvp-9G10 después de provocarle AHPND, sugiere que el anticuerpo VLRB puede proporcionar protección contra una infección por V. parahaemolyticus en los camarones. Se considera que la razón detrás de la eficacia del anticuerpo PirBvp-9G10 en este estudio, podría deberse a los abundantes residuos hidrofóbicos en la estructura de PirBvp, que el anticuerpo VLRB reconoce fácilmente y de los que PirAvp carece.

Sin embargo, en general, estos resultados sugieren claramente que el anticuerpo VLRB PirBvp-9G10 puede mejorar la supervivencia de los camarones contra V. parahaemolyticus, solo dirigiéndose a la toxina virulenta PirBvp. En resumen, los datos de un informe anterior que mostraba que solo la toxina PirBvp podía inducir signos histológicos de AHPDH, y otro que afirmaba que la virulencia de AHPND depende en gran medida de la cantidad de toxinas secretadas por las células bacterianas, corroboran en gran medida el objetivo de este estudio de desarrollar nuevos agentes terapéuticos para AHPND dirigidos a la toxina PirBvp.

Además, la eficacia de los anticuerpos VLRB como agentes inmunogénicos para inmunizar de forma pasiva a los camarones criados en altas densidades de población, podría ayudar significativamente a la industria a combatir los brotes de AHPND.

Esta es una versión resumida desarrollada por el equipo editorial de Panorama Acuícola Magazine del artículo “PASSIVE IMMUNIZATION WITH RECOMBINANT ANTIBODY VLRB-PirAVP/PirBVP—ENRICHED FEEDS AGAINST VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS INFECTION IN LITOPENAEUS VANNAMEI SHRIMP” escrito por JASSY MARY S. LAZARTE, YOUNG RIM KIM, JUNG SEOK LEE, JIN HONG CHUN, SI WON KIM, JAE WOOK JUNG, JAESUNG KIM, PATTANAPON KAYANSAMRUAJ, KIM D. THOMPSON, HYEONGSU KIM, AND TAE SUNG JUNG.
La versión original fue publicada en ENERO de 2021 a través VACCINES. Se puede acceder a la versión completa a través de https://doi.org/10.3390/vaccines9010055

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