Hallazgos recientes indican que el uso preventivo de cepas probióticas con capacidad de colonización aumenta la protección de las larvas, lo que representa una estrategia prometedora en el control de la enfermedad de necrosis hepatopancreática aguda en criaderos de larvas de camarón.
Las enfermedades bacterianas producidas o inducidas por especies del género Vibrio han causado importantes pérdidas económicas en el cultivo de camarones en todo el mundo, debido a tasas de mortalidad masiva de hasta 100%.
Un ejemplo reciente es la enfermedad de necrosis hepatopancreática aguda (AHPND, por sus siglas en inglés) que afecta principalmente a postlarvas (PL) y camarones peneidos juveniles.
Diversas investigaciones revelan que la AHPND es causada por cepas virulentas de Vibrio parahaemolyticus, portadoras del plásmido virulento PVA1 que contiene los genes de las toxinas PirA y PirB. Lai et al. (2015) determinaron que cuando V. parahaemolyticus coloniza el estómago del camarón, este comienza a producir toxinas PirA y PirB, las cuales llegan a la hepatopáncreas, provocando lesiones graves.
“En Centroamérica se han reportado pérdidas debidas a la AHPND en criaderos de larvas de camarón; mientras que, estudios epidemiológicos realizados en Suramérica en 2017, indicaron que la alta mortalidad registrada en criaderos estaba asociada con V. parahaemolyticus, portador de estas toxinas.”
La vibriosis se ha tratado de manera tradicional con antibióticos con fines profilácticos y terapéuticos con pobres resultados, además de inducir resistencia bacteriana, incluso en V. parahaemolyticus, existiendo el riesgo de acumulación de residuos en el ambiente. En Ecuador, distintos estudios con bacterias marinas aisladas localmente, han demostrado tener efectos beneficiosos en cultivos de Penaeus vannamei.
Se determinó que la supervivencia y el rendimiento de estanques sembrados con larvas de camarón tratados con Vibrio diabolicus (Ili) fue mayor en comparación con estanques sembrados con larvas no tratadas.
“El Vibrio hepatarius (P62) y la cepa probiótica P64, recientemente identificada como cepa probiótica Bacillus cereus sensu stricto, incrementaron la respuesta inmune de juveniles de P. vannamei, resultando en un efecto positivo sobre la supervivencia en estanques tratados (Gullian et al., 2004; Aguayo et al., 2009).”
En este artículo se presentan los resultados de un estudio cuyo objetivo fue caracterizar la presencia de apéndices de bacterias en la superficie celular en las cepas probióticas, mediante microscopía electrónica de barrido en modo de transmisión; para luego evaluar la capacidad de colonización de los probióticos marcados en las PL de P. vannamei utilizando microscopía de fluorescencia y confocal.
Materiales y métodos
Los probióticos V. diabolicus (cepa Ili), V. hepatarius (cepa P62), B. cereus s.s. (cepa P64) y V. parahaemolyticus (cepa BA94C2) patógeno causante de AHPND en camarones, fueron proporcionados por el Departamento de Microbiología del Centro de Investigación Nacional de Acuicultura y Marina (CENAIM, ESPOL).
“Inicialmente, las tres cepas de probióticos se caracterizaron mediante microscopía electrónica de barrido. Luego, se determinó la capacidad de colonización de estas en larvas de camarón P. vannamei mediante su exposición directa a probióticos previamente teñidos con colorantes flurocromos, naranja de acridina (AO, por sus siglas en inglés), azul de Evans y 4′, 6-diamidina-2-fenilindol (DAPI).”
Las larvas se observaron por medio de epifluorescencia y microscopía confocal. Al final, se evaluó el consorcio de probióticos en larvas de P. vannamei en un cultivo de larvicultura (Nauplii 5 hasta PL8), donde se aplicaron los tres probióticos diariamente. El ensayo incluyó un grupo control sin la aplicación de probióticos.
Después de 16 días de cultivo, las larvas tratadas con el consorcio microbiano y el grupo control fueron desafiadas con una cepa patógena de V. parahaemolyticus causante de AHPND.
Resultados
Caracterización morfológica de las cepas probióticas
En la Figura 1, se muestran microfotografías de microscopía electrónica de barrido centradas en la observación de fimbrias y flagelos en las células. Celularmente, Ili es ovalado, presentando extremos redondeados con un tamaño de 1.3 a 2.2 μm de largo y 0.6 a 0.9 nm de ancho, con una presencia distintiva de numerosos flagelos laterales (Figura 1A).
P62 tiene células de forma ovalada con un tamaño de 1.4 a 2.7 μm de largo y 0.8 a 1.7 μm de ancho con una estructura de membrana plasmática muy bien definida, donde se anclan las fimbrias (Figura1B). P64 tiene una forma bacilar característica con un tamaño de 1.5 a 2.9 μm de largo y 0.8 a 1.2 μm de ancho, además de una membrana plasmática bien definida con presencia de flagelos y fimbrias (Figure 1C).
Los tres probióticos formaron biopelículas después de 48 h de incubación. Sin embargo, la biopelícula más fuerte la formó la bacteria probiótica Ili (p < 0.05), seguida de P62 y P64. Estos resultados se confirmaron cuando las biopelículas se tiñeron con naranja de acridina.
Ensayos de motilidad en enjambre de bacterias probióticas
El probiótico Ili y P62 presentaron menor motilidad de enjambre a 25°C. Ili alcanzó su máximo crecimiento a 27°C (p <0.05). La migración de Ili fue significativamente mayor a las temperaturas estudiadas que la de las otras bacterias probióticas (p < 0.05).
La motilidad de enjambre de P64 no se vio afectada de forma negativa por la baja temperatura, siendo significativamente mayor (p < 0.05) a 25°C en comparación con el probiótico P62 (Tabla 1).
Ensayo de colonización de bacterias probióticas en larvas de camarón
La microscopía confocal permitió verificar la capacidad de adhesión de las tres bacterias probióticas a la cutícula y tripa del camarón. La Figura 2A muestra la cepa de probiótico Ili adherida a la zona oral. En la Figura 2B, la cepa de probiótico P62 aparece adherida a la membrana peritrófica del intestino.
En la Figura 2C, el probiótico P64 teñido con DAPI se detecta en las células de los urópodos. Se evaluaron las características protectoras de los tres probióticos por su interacción con V. parahaemolyticus causante de AHPND. Las larvas en estado Z3 expuestas a V. parahaemolyticus fueron completamente colonizadas, observándose larvas fuertemente teñidas con AO (Figura 3A).
Si las larvas fueron colonizadas de forma previa con cada probiótico individual, la señal de V. parahaemolyticus fue menor y restringida a la cutícula externa y a una sección del ciego del intestino medio lateral (Figura 3B, C, D).
Cuando las larvas fueron colonizadas por el consorcio de probióticos, solo se detectó una señal débil del Vibrio patógeno en la cutícula externa (Figura 3E y F), y no se detectó ninguna señal en el sistema digestivo.
Las larvas del control negativo exhibieron una débil señal de fluorescencia cuando se trataron con los sobrenadantes de las bacterias teñidas con AO. Solo se detectó fluorescencia natural en las larvas tratadas con el sobrenadante (libre de bacterias) de las bacterias teñidas con DAPI y azul de Evans.
“Ensayos in vivo, prueba de desafío de larvas de camarón cultivadas con la exposición al consorcio de probióticos Al finalizar el cultivo de larvas, la tasa de supervivencia de PL8 tratadas con el consorcio de probióticos fue de 83.8%, sin diferencias significativas al compararla con las larvas no tratadas (84.4%).”
Sin embargo, después del desafío con V. parahaemolyticus, causante de AHPND, la tasa de supervivencia de las larvas tratadas con el consorcio de probióticos fue de 75.33 ± 12.62%, significativamente mayor (p < 0.05) que la de las larvas control (32.27 ± 9.57%).
Discusión
En ambientes de larvicultura, los vibrios patógenos del camarón exhiben la capacidad de proliferar planctónicamente en el agua, así como colonizar de manera rápida al camarón. Por lo tanto, las bacterias probióticas deben ser capaces de competir por estos espacios, exhibiendo habilidades de colonización.
Las observaciones microscópicas, así como los resultados in vitro vivo e in vivo obtenidos en el estudio, indican que los probióticos Ili, P62 y P64 poseen los apéndices de superficie celular necesarios para la colonización de las superficies del huésped. Las larvas expuestas al consorcio probiótico exhibieron una alta supervivencia después del desafío con V. parahaemolyticus que causa AHPND.
“En consecuencia, la aplicación del consorcio probiótico en P. vannamei en criaderos podría proporcionar a las larvas un efecto protector frente a Vibrio spp. patógeno.”
La microscopía electrónica permitió determinar que la robusta motilidad en enjambre observada en el probiótico Ili podría explicarse con la gran cantidad de flagelos laterales que posee esta bacteria. Se establece que el comportamiento bacteriano de motilidad de enjambre sobre superficies sólidas está mediado por flagelos laterales.
El probiótico P64 también se caracteriza por tener flagelos laterales y su motilidad de enjambre es mayor que la del P62, en el cual no se detectaron estos apéndices celulares. Los flagelos laterales no solo facilitan la motilidad de enjambre, sino que contribuyen a la adhesión a la superficie, facilitando la formación de biopelículas (Merino et al., 2006).
“Esto también explicaría porqué se observaron biopelículas más desarrolladas en la cepa Ili. Otra estructura celular bacteriana no flagelar que facilita la formación de biopelículas son las fimbrias. Estas fueron muy abundantes en P62, una bacteria que exhibió biopelículas más robustas que P64, en la que se observaron menos fimbrias.”
En conjunto, los tres probióticos colonizaron las superficies externa e interna de las larvas. La ocupación de estas localizaciones podría ser uno de sus principales mecanismos de acción. En este sentido, cabe señalar que V. parahaemolyticus causante de AHPND infecta al camarón colonizando primero las superficies del estómago, donde genera toxinas que pueden penetrar la hepatopáncreas y, por lo tanto, destruirlo.
Si estos sitios ya están ocupados por probióticos, la patogenicidad de V. parahaemolyticus podría reducirse. Se consiguió la exclusión completa de V. parahaemolyticus causante de AHPND en el intestino cuando se empleó el consorcio de probióticos. En otras palabras, hubo una colonización eficiente del intestino y la cutícula externa por Ili y P62 y una colonización del intestino y la membrana peritrófica del intestino por P64.
“Los tres probióticos generaron una fuerte señal fluorescente en el ciego del intestino medio lateral. Se detectó una fuerte señal fluorescente para P64 en la base de las setas del urópodo y en las células subyacentes, indicando que esta podría ser una posible vía de entrada al menos para este probiótico (Figura 2C).”
De hecho, se observó una fuerte señal de P64 en las células del epitelio intestinal (Figura 4). Por lo tanto, se supone que estas bacterias pueden penetrar en el hemocele del huésped.
Las larvas de camarón cultivadas con el consorcio probiótico exhibieron una mejor supervivencia (75%) cuando fueron expuestas a V. parahaemolyticus causante de AHPND.
Los probióticos adheridos a las cutículas externas y a las superficies internas con capacidad de exclusión competitiva contra el patógeno V. parahaemolyticus puede explicar estos niveles de supervivencia.
Conclusión
Los probióticos Ili, P62 y P64 poseen fimbrias y flagelos, apéndices de la superficie celular, necesarios para la colonización de superficies a través de biopelículas y motilidad de enjambre. Estos probióticos colonizan las larvas de los camarones excluyendo el patógeno V. parahaemolyticus que causa AHPND, hallazgos fundamentales en el desarrollo de nuevos probióticos para la industria acuícola.
Esta es una versión resumida desarrollada por el equipo editorial de Panorama Acuícola Magazine del artículo “THE PROBIOTICS VIBRIO DIABOLICUS (ILI), VIBRIO HEPATARIUS (P62), AND BACILLUS CEREUS SENSU STRICTO (P64) COLONIZE INTERNAL AND EXTERNAL SURFACES OF PENAEUS VANNAMEI SHRIMP LARVAE AND PROTECT IT AGAINST VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS” escrito por MERY RAMÍREZ – Escuela Superior Politécnica del Litoral, ESPOL and Universidad Estatal Península de Santa Elena UPSE; CRISTOBAL DOMÍNGUEZBORBOR – Escuela Superior Politécnica del Litoral, ESPOL; LIZETH SALAZAR, ALEXIS DEBUT y KARLA VIZUETE- Universidad de las Fuerzas Armadas ESPE; STANISLAUS SONNENHOLZNER – Escuela Superior Politécnica del Litoral, ESPOL; FRANK ALEXIS – Universidad Yachay Tech; JENNY RODRÍGUEZ – Escuela Superior Politécnica del Litoral, ESPOL.
La versión original, incluyendo tablas y figuras, fue publicada en DICIEMBRE de 2021 en ACUACULTURE.
Se puede acceder a la versión completa a través de https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2021.737826
