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Identificación de nuevas cepas de Vibrio campbellii portadoras del plásmido pVA1, aisladas en postlarvas de Penaeus vannamei afectadas por brotes de necrosis hepatopancreática aguda (AHPND) en México

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Por: El Equipo de Redacción de Panorama Acuícola Magazine

En la actualidad, la enfermedad de necrosis hepatopancreática aguda (AHNPD, por sus siglas en inglés) continúa produciendo grandes pérdidas en las granjas de camarones mexicanas. En este artículo, se presenta el resumen de los signos clínicos, lesiones histopatológicas, análisis bacteriológicos e identificación de los aislados obtenidos en tres brotes naturales de AHPND en postlarvas de Penaeus vannamei obtenidas de tres criaderos locales.

Las enfermedades que afectan a las postlarvas (PL) o a los primeros estadios juveniles de los camarones de piscifactoría son una de las principales limitaciones para la sostenibilidad de la industria camaronera.

La necrosis hepatopancreática aguda (AHPND, por sus siglas en inglés), causada principalmente por Vibrio parahaemolyticus (Vp AHPND), sigue siendo la enfermedad bacteriana de mayor importancia económica que afecta tanto al camarón tigre (Penaeus monodon) como al camarón blanco del Pacífico (Penaeus vannamei) (FAO, 2013).

En México, la enfermedad se detectó en 2013 en granjas de camarón, causando pérdidas de producción del 70% (Nunan et al., 2014).

Identificación de nuevas cepas de Vibrio campbellii portadoras del plásmido pVA1, aisladas en postlarvas de Penaeus vannamei afectadas por brotes de necrosis hepatopancreática aguda (AHPND) en México

Actualmente, la AHPND sigue produciendo grandes pérdidas en el cultivo de camarón, pero no se ha publicado ningún informe científico sobre la mortalidad en granjas y criaderos de camarón. En este estudio se analizaron las causas de mortalidad y morbilidad en postlarvas de camarón con signos clínicos de AHPND provenientes de criaderos comerciales de México, empleando métodos de secuenciación del genoma completo (WGS, por sus siglas en inglés).

Materiales y métodos

Para esta investigación, se transportaron los lotes de PL de camarón de tres criaderos comerciales locales de camarón (Penaeus vannamei) a las instalaciones del Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo (CIAD), Unidad AC Mazatlán.

Después de su llegada, los camarones fueron transferidos inmediatamente a tanques redondos de fibra de vidrio de 400 L y se mantuvieron de acuerdo con las condiciones de cultivo del criadero (agua de mar natural a una salinidad de 35 g L¹, pH de 7.8 – 8.1, temperatura de 30C y fotoperiodo de 12 h luz/12 h oscuridad).

Se empleó un sistema de flujo abierto de agua de mar para cada lote, y las PL se alimentaron tres veces al día con dietas comerciales, sin complementos probióticos. Dos veces al día, se realizaron observaciones de los signos externos de enfermedad, como comportamiento natatorio, cromatóforos, color del hepatopáncreas, tubo digestivo vacío y actividad larvaria.

Los protocolos de PCR descritos en la Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE, por sus siglas en inglés, 2022) se aplicaron para la detección de los virus del síndrome de la mancha blanca (WSSV), necrosis hipodérmica y hematopoeitica infecciosa (IHHNV), y síndrome de taura (TSV), siendo las mismas pruebas de diagnóstico en cada lote.

Resultados

En el primer, segundo y tercer brote, el peso de las PL fue de 80 a 190 mg, 180 a 310 mg y 80 a 240 mg, de manera respectiva. Al principio de la aclimatación, no se observaron signos clínicos de enfermedades, y la detección por PCR de WSSV, IHHNV, TSV y AHPND fue negativa en todos los lotes. Sin embargo, cuando se aplicó el método de enriquecimiento (segundo lote), siete de cada diez muestras de PL sin signos clínicos resultaron presuntamente positivas para AHPND.

Durante los primeros días de aclimatación, las PL mostraron una actividad normal en todos los lotes. Al cabo de tres o cuatro días, se produjo una mortalidad que osciló entre el 70 y el 80% en todos los tanques (Figura 1a), observándose signos clínicos de AHPND como tracto digestivo vacío (estómago e intestino), hepatopáncreas pálido y atrofiado, nado errático, anorexia y letargo (Figura 1b).

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Todas las PL con signos clínicos de AHPND de los tres brotes mostraron cambios histopatológicos asociados a la fase aguda, terminal o de remisión de la AHPND. Las lesiones del hepatopáncreas en la fase aguda evidenciaron desprendimiento masivo de células en la lumen tubular, infiltración hemocítica leve y ausencia de vacuolas en las células epiteliales tubulares.

El hepatopáncreas con lesiones en fase terminal reveló una melanización grave y necrosis del tejido hepatopancreático con una masa abundante de bacterias en el tejido necrótico. Las PL sin signos clínicos de AHPND no presentaron cambios patológicos.

La densidad de Vibrio-like y las colonias verdes en tiosulfatocitrato-sales biliares-sacarosa (TCBS) mostraron resultados diferentes para cada brote de AHPND. Dado que los datos carecían de normalidad, se aplicó la prueba de suma de rangos de Mann-Whitney para comparar Log CFU g¹ entre el hepatopáncreas y el estómago, así como el porcentaje de colonias verdes en TCBS de PL AHPND+ y AHPND- para los tres brotes (Tabla 1).

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Las colonias verdes en el hepatopáncreas de las PL AHPND+ oscilaron entre el 58 y el 77%, en comparación con las de las PL AHPND-, que oscilaron entre el 13 y el 51%.

Se identificó un total de 11 especies conocidas, y también se detectaron dos nuevas especies potenciales de Vibrio. Las seis cepas mexicanas de Vibrio campbellii están muy estrechamente relacionadas (> 0.9996 ANI); aun así, cada una tiene algunos genes, entre 4 y 20, que solo se encuentran en esa cepa (Figura 2; anvi’o), por lo que no se pueden considerar clones.

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Los genes pirAB, responsables de producir la delta-endotoxina que causa AHPND, solo se detectaron en los seis genomas identificados como V. campbellii, en lo que parece ser un plásmido conjugado muy similar al descrito previamente para la cepa M0904 de V. parahaemolyticus identificada en 2013 en una localidad cercana.

Discusión

El noroeste de México domina la producción semiintensiva de camarón de cultivo, con la mayoría de los criaderos comerciales ubicados en la región. El estado de Sinaloa alberga alrededor de 900 granjas y 50 criaderos de camarón, todos ubicados de manera estratégica dentro de instalaciones de bioseguridad con el objetivo de mejorar la producción.

Sin embargo, en 2020 y 2021, el 38% y el 31% de las granjas, respectivamente, se vieron afectadas por enfermedades infecciosas. La AHPND sigue siendo una preocupación importante para el gobierno mexicano y la industria camaronícola (SENASICA, 2020).

“En principio, aunque la mortalidad en los criaderos de camarón se ha atribuido a las toxinas de las floraciones de algas en los últimos años, los resultados presentados en este estudio demuestran que los brotes en PL se asociaron con la presencia de aislados de pirAB+, incluso a densidades por debajo del umbral infeccioso (Soto-Rodríguez et al., 2015).”

Los brotes de AHPND se produjeron entre 72 y 96 h después del transporte de las PL. Los signos clínicos y las lesiones histopatológicas fueron similares a los reportados previamente para AHPND (Tran et al., 2013; Soto-Rodríguez et al., 2022; Lozano-Olvera y Abad-Rosales, 2023).

Los indicadores comunes incluían tractos digestivos vacíos, hepatopáncreas pálido a blanquecino y desprendimiento masivo de células epiteliales, característico de la fase aguda de la AHPND. Además, se observó hepatopáncreas con necrosis melanizada durante las fases terminal y de remisión. Las cepas V. campbellii pirAB+ se estudiarán en el futuro en desafíos con PL y camarones juveniles para registrar el proceso infeccioso de la AHPND.

Los resultados mostraron que los microorganismos benéficos del agua de cría fueron eliminados bajo las condiciones de transporte y laboratorio (agua de mar con filtro de 5-10 μm, 29 ± 1C, aireación y fotoperiodo de 12 h de luz/12 h de oscuridad).

Identificación de nuevas cepas de Vibrio campbellii portadoras del plásmido pVA1, aisladas en postlarvas de Penaeus vannamei afectadas por brotes de necrosis hepatopancreática aguda (AHPND) en México

En México, una práctica actual común de los criaderos y viveros de camarón es el uso de sistemas de agua madurada; implica la aplicación de diversos probióticos comerciales y caseros, así como postbióticos, enzimas, levaduras, melazas y, en ocasiones, en combinación con la tecnología biofloc.

El sistema de cría en agua comprende un complejo consorcio de bacterias, levaduras y protozoos que cohabitan con las larvas de camarón. Silva et al. (2012) informaron que un probiótico comercial no influyó en la supervivencia y el crecimiento de las PL de P. vannamei, aunque hubo una reducción en el recuento de Vibrio-like en el agua y los camarones.

“En este estudio, los resultados de los vibrios en las PL dependieron del criadero; sin embargo, se encontró una mayor densidad de vibrios y colonias verdes en el hepatopáncreas de las PL AHPND+ en comparación con los camarones AHPND-, lo que puede indicar que la infección secundaria es más rápida en las PL.”

Este es el primer reporte, usando WGS, de cepas de V. campbellii, portadoras de los genes tóxicos pirA y pirB aisladas de PL de camarón en criaderos comerciales mexicanos. Anteriormente, las especies de Vibrio causantes de brotes de AHPND se presentaban solo en granjas camaronícolas.

La identificación fiable de las cepas de Vibrio spp encontradas en granjas acuícolas es muy importante, ya que podría emplearse para vigilar la propagación y la aparición de AHPND. Seguramente seguirán apareciendo nuevas especies de Vibrio pirAB+ en las granjas de camarón de todo el mundo.

Al cabo de tres o cuatro días, se produjo una mortalidad que osciló entre el 70 y el 80% en todos los tanques. Se observaron signos clínicos de AHPND, como tracto digestivo vacío (estómago e intestino), hepatopáncreas pálido y atrofiado, nado errático, anorexia y letargo.

Conclusiones

Las postlarvas aparentemente sanas de P. vannamei procedentes de criaderos de camarón desarrollaron signos clínicos y lesiones histopatológicas características de AHPND después de 72 a 96 h de su transporte. El plásmido similar a pVA1 se identificó en todos los genomas de las cepas de V. campbellii, lo que confirmó la presencia de genes pirAB, por primera vez, en PL procedentes de criaderos comerciales mexicanos, lo que constituye una gran amenaza para la industria camaronera.

La mayoría de los aislados de los brotes fueron vibrios (93%), incluidas dos nuevas especies de Vibrio como parte de la microbiota asociada a las PL.

Esta es una versión resumida desarrollada por el equipo editorial de Panorama Acuícola Magazine del artículo “IDENTIFICATION OF NEW VIBRIO CAMPBELLII STRAINS HARBORING THE PVA1 PLASMID ISOLATED FROM PENAEUS VANNAMEI POSTLARVAE AFFECTED BY OUTBREAKS OF ACUTE HEPATOPANCREATIC NECROSIS DISEASE (AHPND) IN MEXICO” escrito por SOTO-RODRÍGUEZ, S., GÓMEZ-GIL, B., LOZANO-OLVERA, R., y AGUILAR-RENDÓN, K. – CIAD, AC Unidad Mazatlán para Acuicultura y gestión medioambiental, GONZÁLEZ GÓMEZ, J. CIAD, AC Unidad Culiacán.
La versión original, incluyendo tablas y figuras, fue publicada en OCTUBRE de 2023 en AQUACULTURE. Se puede acceder a la versión completa a través de https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2023.7402

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