Por: Redacción de PAM*
La producción de camarones en Indonesia se encuentra entre las mayores del mundo, la cual se ha visto afectada por la enfermedad de necrosis hepatopancreática aguda (AHPND, por sus siglas en inglés). Este artículo resume los resultados de una investigación cuyo objetivo es determinar la biofabricación, caracterización y eficacia de nanopartículas de oro mediada por Chaetoceros calcitrans como antibacteriano contra AHPND en camarón blanco del Pacífico.
Introducción
Indonesia es el tercer exportador mundial de camarones, después de Ecuador y la India. La producción de camarones aumentó un 21%, de 1.21 millones de toneladas a 1.48 millones de toneladas en 2021-2022, pero disminuyó a 1.097 millones de toneladas en 2023 (KKP, 2023). Sin embargo, uno de los obstáculos que siguen enfrentando los acuicultores son las enfermedades.
La enfermedad de la necrosis hepatopancreática aguda (AHPND, por sus siglas en inglés) es una de las causas del descenso de la producción, porque provoca la muerte del 100% de los camarones L. vannamei y solo hasta un 35% de los acuicultores son capaces de completar un ciclo de cultivo con una supervivencia del 50% de la población. Por lo tanto, es necesario innovar en el manejo del AHPND para evitar mayores pérdidas, considerando que el camarón blanco del Pacífico (Litopenaeus vannamei) es uno de los principales productos de exportación.
La AHPND es causada por Vibrio parahaemolyticus, que tiene un plásmido virulento único, el cual contiene el gen de la toxina Pir. La toxina Pir consiste en ToxA y ToxB codificadas por los genes Pir-A y Pir-B. Esta toxina forma un complejo heterodimérico que se une a los receptores en el hepatopáncreas del camarón, causando necrosis aguda.
La AHPND en el L. vannamei se trata con sifonado y antibióticos. El sifonado no es eficaz para reducir los niveles de amoníaco en el agua, por lo que los camarones experimentan estrés y se inhibe su crecimiento; mientras que altas dosis de antibióticos causan resistencia bacteriana y dejan residuos. Rezaee et al. (2020) demostraron que los bacteriófagos pueden inhibir la bacteria V. parahaemolyticus, pero también causar resistencia a las bacterias patógenas. Solo Sun et al. (2023) reportaron que las nanopartículas de oro (Np-Au) pueden detectar V. parahaemolyticus en el camarón blanco del Pacífico, no así como agentes antimicrobianos.
Las Np-Au son un tipo de nanopartículas metálicas usadas como portadoras y estabilizadoras de fármacos. Las nanopartículas metálicas tienen un mecanismo de toxicidad inespecífico único, a la que las bacterias no son resistentes (Hassan et al., 2023). Sin embargo, su toxicidad es elevada en los organismos objetivo y en el medio ambiente. El método de biosíntesis de nanopartículas metálicas con plantas herbáceas, fitoplancton y poliquetos puede reducir su toxicidad.
Los metabolitos secundarios en materiales naturales como: aminoácidos, ácido cítrico, terpenoides, polifenoles y polioles pueden funcionar como agentes reductores, así como agentes de recubrimiento (estabilizadores) para nanopartículas de iones metálicos (Pal et al., 2019; Wang et al., 2019). Este método es superior porque es respetuoso con el medio ambiente, eficiente energéticamente (temperatura ambiente) y con un uso mínimo de productos químicos. Hassan et al. (2023) investigaron más a fondo las Np-Au con Marphysa morbidi (polychaeta) como antibacteriano para la AHPND.
El contenido bioactivo de fenoles, ésteres y ácidos grasos en M. morbidi puede reducir la toxicidad y estabilizar los iones metálicos Au3+ en nanopartículas Au0. Sin embargo, la extracción de principios activos en M. morbidi se considera subóptima debido a los disolventes menos polares y orgánicos y la dificultad de su obtención, porque se encuentra en la costa de Malasia, por lo que es necesario disponer de un M. morbidi alternativo como reductor y estabilizador de Np-Au.
Chaetoceros calcitrans es una especie universal de la clase Bacillariophyceae y se encuentra ampliamente en la costa de Pamekasan, Java Oriental, con una densidad de entre 700 y 9,100 ind/L en julio – agosto (Indriyawati et al., 2023). Contiene muchos metabolitos secundarios: terpenoides, flavonoides, taninos y esteroides que pueden inhibir las bacterias patógenas. Soto-Rodríguez et al. (2021) reportaron que los compuestos hidrofílicos de las células de C. calcitrans poseen actividad antibiótica contra V. parahaemolyticus M0904, una cepa responsable de la AHPND. Sin embargo, su actividad antibiótica es todavía baja por lo que necesita ser optimizada.
La extracción óptima de poliquetos se realiza con metanol, el cual es tóxico, razón por la que se requieren alternativas similares como el etanol que son más seguras. En resumen, los metabolitos secundarios de C. calcitrans tienen un gran potencial como agentes reductores y estabilizadores de Np-Au, a través de métodos de biosíntesis, para producir antibacterianos AHPND efectivos a bajas dosis que no causen resistencia bacteriana ni residuos, y puedan usarse a largo plazo.
Metodología de la investigación
La investigación experimental se llevó a cabo durante cuatro meses (mayo – agosto), en la cual se emplearon: C. calcitrans, etanol al 96%, HAuCl4.3H2O 1 mM, V. parahaemolyticus aislado en 108 UFC/ml (estándar de 0.5 McFarland), medio tiosulfato, citrato, sal biliar y sacarosa (TCBS, por sus siglas en inglés), agar para recuento en placa (PCA), agar Mueller Hinton (MHA), caldo nutritivo (NB), agua destilada, disco de papel, microtips, toallas de papel y alcohol al 70%.
La extracción de C. calcitrans se adoptó de Maftuch et al. (2018). La C. calcitrans se obtuvo del Centro de Cultivo de Agua Salobre (BPBAP, por sus siglas en inglés), Jepara. El polvo de C. calcitrans se dejó en remojo en etanol al 96% (1:6). Se maceró durante 1×24 horas, se filtró y se concentró empleando un evaporador rotativo de vacío a 60ºC hasta que se convirtió en una pasta.
La biofabricación de Np-Au se inició tomando 20 mL de solución de 1 mM más 5 mL de extracto crudo de C. calcitrans, con un pH ajustado a 7.8. La mezcla se agitó durante 1 hora hasta que el color cambió a rojo rubí o púrpura, se incubó durante 24 horas y se observó periódicamente el cambio de color. Las Np-Au obtenidas se caracterizaron por UV-Vis, FTIR (Shimadzu, IRTracer-100), SEM (Thermo Fisher Scientific Phenom P-Series), TEM ( Jeol JEM-1400), PSA (Biobase BK-802N) y XRD (Rigaku, Japan).
Como técnicas de caracterización se emplearon el análisis UV-Vis para determinar el valor de la resonancia de plasmón superficial (SPR, por sus siglas en inglés) y la longitud de onda máxima del gráfico de absorción estable de las Np-Au (Au0), y el análisis PSA (Particle Size Analyzer) para determinar el tamaño de las Np-Au, en función del diámetro hidrodinámico (Dh) y del índice de polidispersidad (PDI), que indica la distribución del tamaño de las partículas.
Resultados y discusión
Resultados de la biofabricación de Np-Au mediada por C. calcitrans
El indicador inicial del éxito de la biofabricación de Np-Au viene marcado por el cambio de color de la solución de amarillo pálido a rojo rubí tras la adición del extracto de C. calcitrans y la incubación de 24 horas.
El color rojo rubí indica que se ha formado Np-Au estable. Esto coincide con la investigación de Hassan et al. (2023), según la cual el cambio de color de amarillo a rojo oscuro, a azul o púrpura indica la formación de Np-Au, fenómeno causado por la reducción de iones Au3+ a Au0 por compuestos metabolitos secundarios del extracto de C. calcitrans como: fenoles, aminoácidos, terpenoides y flavonoides (Okunowa, 2019). La reducción se produce debido a la interacción de las fuerzas electrostáticas de los grupos hidroxilo y carbonilo de los metabolitos secundarios cargados negativamente con la carga positiva de la solución de oro Au3+.
Análisis UV-Vis
El color rojo rubí del Np-Au se caracterizó cuantitativamente mediante UV-vis para determinar la SPR máxima (λmax nm). La excitación de las vibraciones SPR en la solución de Np-Au provoca el cambio de color. La SPR típica de las Np-Au se sitúa entre 520 nm y 560 nm (Ee Pei et al., 2020). Basándonos en la Figura 1, se biofabricó con éxito Np-Au estable con la ayuda del agente de recubrimiento C. calcitrans, mostrando la aparición de un único máximo de absorción a λ= 533 nm.
La SPR de Np-Au que se encuentra en el rango de 530-555 nm es posible que sea esférica (Osibe y Aoyagi, 2019). La diferencia en el tamaño de las Np-Au también afecta su absorbancia. El valor de absorbancia de las Np-Au que miden 10-100 nm tiene un rango SPR de 517-575 nm (Manzila et al., 2020).
Análisis FTIR
Los grupos funcionales del extracto de C. calcitrans, como aminas, carbohidratos, proteínas y aminoácidos, pueden actuar como agentes de recubrimiento, reductores y estabilizadores de las Np-Au. Según los resultados de FTIR (Figura 2), existe un pico amplio de gran intensidad a 3,473 cm-1 que indica la vibración de estiramiento del -OH fenólico del extracto de C. calcitrans (Fouda et al., 2022). La absorción a 2,366.66 – 2,335.80 cm-1 indica la vibración de estiramiento de los enlaces C≡C (alquino) (Geetha et al., 2013), 2,073 cm/cm amplia absorción con baja intensidad es la vibración de estiramiento del grupo HC≡N (Ee Pei et al., 2020).
La reducción en la biofabricación de Np-Au por C. calcitrans se llevó a cabo con éxito, como indica la presencia de absorción en el número de onda 1,639 cm-1 de la vibración de estiramiento simétrico de C=O de grupos funcionales flavonoides o iones carboxilato, y 1,361 cm-1 que indica la vibración de estiramiento de aminas alifáticas C-N, ambas originadas por el residuo de aminoácido polipeptídico del enlace Np-Au que funciona como agente de recubrimiento (estabilizador) de Np-Au (Suryakala et al., 2022), y 601 cm-1 que indica Au-O.
Estas características indican que los grupos funcionales típicos de C. calcitrans se encuentran alrededor de Au0 en las Np-Au después de que se produzca la biofabricación.
Análisis SEM
La morfología de las Np-Au biofabricadas es predominantemente esférica (Figura 3a). Estos resultados concuerdan con la biosíntesis de Np-Au usando materiales naturales y poliquetos (Suryakala et al., 2022; Hassan et al., 2023). Además de ser esféricas, también presentan una morfología irregular a mayor aumento (Figura 3b).
Análisis TEM
La morfología de los resultados de la biosíntesis de Np-Au en TEM coincide con la de SEM, en la que predomina una forma redonda. También se confirmaron formas trigonales y tetragonales irregulares a aumentos de 20,000 y 80,000 veces. Mientras tanto, el tamaño de las partículas de Np-Au producidas también varía, a saber: 50, 100 y 200 nm. El tamaño de Np-Au está influido por el pH de la biosíntesis de Np-Au (pH 7.8). Cuanto menor es el pH, mayor es el tamaño de partícula porque el grupo hidroxilo del agente de recubrimiento está protonado, lo que reduce su reactividad (Annur, 2018). Por lo tanto, la distribución del tamaño de las partículas de Np-Au varía.
Análisis PSA
Los resultados del análisis PSA muestran que el tamaño medio de partícula de las Np-Au biosintetizadas con C. calcitrans es de 8.25 nm (Figura 4), en línea con la afirmación de Osibe y Aoyagi (2019) respecto a que el tamaño de partícula de las Np-Au oscila entre 2-20 nm. Este valor es menor que los resultados del TEM, lo cual es posible porque el TEM puede mostrar la morfología y el diámetro de las Np-Au con gran precisión.
Así, el tamaño de partícula del Np-Au formado varía, a saber: 8.25, 50, 100 y 200 nm. El PDI del Np-Au se obtuvo en 0.12, lo que indica que el tamaño de partícula se distribuyó de forma polidispersa y homogénea, reforzando los resultados TEM anteriores, que mostraron una variedad de morfologías de Np-Au (redonda, trigonal y tetragonal irregular).
Análisis XRD
Según el difractograma (Figura 5), hay cuatro picos de difracción característicos de Np-Au 2θ en 31.7, 45.4, 66.2, 75.2 y 83.9, que corresponden a los patrones de difracción de Bragg en (111), (200), (220) y (311) respectivamente (Hassan et al., 2023). Existe un desplazamiento en el pico 2θ de Np-Au respecto al patrón de Np-Au según JCPDS 04-0784. Este pico indica la pureza de las nanopartículas de oro formadas, por lo que el desplazamiento puede deberse a varios factores, a saber:
1) el contenido de abundantes compuestos de metabolitos secundarios de C. calcitrans unidos a la superficie de Np-Au,
2) la oxidación de grupos hidroxilo en el agente de recubrimiento, y
3) cambios en la red cristalina fcc (face centered cubic) de las Np-Au (Suryakala et al., 2022).
Conclusión
Basándose en los resultados de la investigación, la biofabricación se formó con éxito con la caracterización UV-vis a una longitud de onda de 533 nm, y en la prueba FTIR el grupo Au3+ fue reducido por el compuesto bioactivo C. calcitrans. Los resultados de los ensayos SEM y TEM mostraron que en las nanopartículas predominaba una forma esférica, el tamaño de partícula según el ensayo PSA fue de 8.25 nm y el ensayo XRD evidenció que se había formado una cristalización de Np-Au con la aparición de un pico de alta intensidad.
Esta es una versión resumida desarrollada por el equipo editorial de Panorama Acuícola Magazine del artículo “Characterization of Gold Nanoparticle (NP-AU) Biosynthesis with Bioreductor Chaetoceros calcitrans as a Disease Inhibitory Power of AHPND in Vannamei Shrimp (Litopenaeus vannamei)” escrito por DESMIEATA, D.; SOFIYA AMALINA, DHEA PUSPITA HAKIM, ISAC MUHAMAD KAHLIL GIBRAN, AZIZAH RAIHANI PURNAMA, PRAYOGO, & ARIF HABIB FASYA – Airlangga University, Banyuwangi. La versión original, incluyendo tablas y figuras, fue publicada en OCTUBRE de 2024 en JOURNAL OF AQUACULTURE SCIENCE. Se puede acceder a la versión completa a través de https://e-journal. unair.ac.id/JoAS.
