Por: Redacción de PAM*
La acuicultura del camarón se enfrenta a importantes desafíos derivados de enfermedades bacterianas y virales, como la necrosis hepatopancreática aguda (AHPND, por sus siglas en inglés) y el virus del síndrome de la mancha blanca (WSSV). Investigaciones recientes destacan el potencial de Lactiplantibacillus plantarum (FD-LAB) como inmunoestimulante dietético para mejorar la inmunidad del camarón. El análisis del transcriptoma reveló que la suplementación con FD-LAB modula los genes relacionados con la inmunidad y los ARN circulares (circARN), lo que potencia la memoria inmunitaria y la resistencia a patógenos.
La acuicultura del camarón desempeña un papel crucial en la seguridad alimentaria mundial, pero se enfrenta a importantes retos, sobre todo debido a las enfermedades que causan graves pérdidas económicas, especialmente en Asia. Entre las principales enfermedades figuran infecciones bacterianas como la necrosis hepatopancreática aguda (AHPND, por sus siglas en inglés) y amenazas virales como el virus del síndrome de la mancha blanca (WSSV).
Debido a su falta de inmunidad adaptativa, los camarones dependen de las respuestas inmunitarias innatas para combatir los patógenos. Con el fin de mejorar su inmunidad, esta investigación se centra en los inmunoestimulantes, que aumentan su resistencia a las enfermedades. Entre ellos, hay compuestos sintéticos y sustancias derivadas de plantas, hongos y bacterias.
Las bacterias lácticas (LAB, por sus siglas en inglés), como Lactiplantibacillus plantarum, se usan ampliamente en la acuicultura del camarón como inmunoestimulantes dietéticos. Los estudios han demostrado que la suplementación con LAB mejora el crecimiento, la composición del microbioma intestinal y las respuestas inmunitarias en Penaeus vannamei, lo que aumenta las tasas de supervivencia frente a las infecciones.
Los avances en el análisis del transcriptoma han profundizado la comprensión acerca de la inmunidad del camarón, incluidas las respuestas inmunitarias a la AHPND y el WSSV. Además, los ARN no codificantes, como los ARN circulares (circARN), regulan la expresión génica inmunitaria. Sin embargo, los efectos de la inmunoestimulación sobre la expresión de circARN no se han estudiado lo suficiente.
La “inmunidad entrenada”, un concepto reciente en la inmunidad de los crustáceos, sugiere que la exposición a inmunoestimulantes como L. plantarum liofilizado (FD-LAB, por sus siglas en inglés) puede aumentar la memoria inmunitaria en P. vannamei, mejorando la resistencia a infecciones secundarias. Este artículo resume los resultados de una investigación acerca del potencial de FD-LAB para desarrollar la inmunidad del camarón blanco del Pacífico.
Materiales y métodos
✓ Camarón y preparación del alimento: los juveniles de P. vannamei (0.87 ± 0.24 g) se dividieron en grupos de control y FD-LAB, y se aclimataron durante siete días. El alimento se suplementó con L. plantarum liofilizado (FD-LAB) a una concentración de 34.2 mg/g. Los camarones se cultivaron en tanques de recirculación con monitoreo del agua y se alimentaron tres veces al día durante 8 o 15 días.
✓ Extracción de ARN y secuenciación: se extrajo el ARN total de los tejidos de las branquias y el estómago de los camarones y se evaluó su calidad. Para la preparación de la biblioteca se empleó el kit Illumina Stranded mRNA Prep y, posteriormente, se llevó a cabo la secuenciación en una plataforma Illumina MiSeq.
✓ Análisis del transcriptoma y del circARN: el control de calidad y el análisis de la expresión diferencial se realizaron empleando herramientas bioinformáticas como STAR, RSEM y DESeq2. La detección de circARN se llevó a cabo utilizando el CIRIquant pipeline.
✓ Validación qPCR: los genes expresados diferencialmente (DEG, por sus siglas en inglés) y los circARN se validaron mediante qPCR. El ARN se transcribió inversamente y se amplificó empleando “primers” específicos.
✓ Pruebas de desafío bacteriano y viral: los camarones fueron expuestos por inmersión a Vibrio parahaemolyticus (AHPND) o WSSV. Se analizaron las tasas de supervivencia mediante el método de Kaplan-Meier, incluyendo pruebas adicionales de inmunidad entrenada.
Resultados
Resumen de la calidad y la secuenciación del ARN
Se realizó la secuenciación del ARN en muestras de branquias y estómago de camarón blanco del Pacífico tras 8 y 15 días de alimentación con FD-LAB o con alimento de control. La secuenciación generó aproximadamente 180 millones de lecturas de alta calidad (Q>30), lo que permitió realizar análisis posteriores fiables.
Perfil del transcriptoma y cambios en la expresión génica
La suplementación con FD-LAB produjo una expresión génica diferencial (DEG):
✓ En el estómago se observaron 14 DEG (8 días) y 22 DEG (15 días), y en las branquias, 80 DEG (8 días) y 40 DEG (15 días) (Figura 1).
✓ El estómago presentó 14 DEG (8 días) y 22 DEG (15 días).
✓ Se reguló al alza a 17 genes y a la baja a 103.
✓ Los DEG incluían genes relacionados con el sistema inmunitario implicados en el reconocimiento de patógenos, la respuesta antimicrobiana y la memoria inmunitaria.
✓ Otras vías enriquecidas fueron la transcripción, la traducción, la ecdisis y los procesos metabólicos.
Validación qPCR de DEG
La qPCR confirmó los resultados de la secuenciación de ARN (RNA-seq, por sus siglas en inglés) y validó los cambios en la expresión génica relacionados con la inmunidad:
✓ En las branquias se observó un aumento del factor antilipopolisacárido (ALF) a los 8 días y de la ficolina-1 (FCN1) a los 15 días, así como una disminución de la mucina 5ac (Muc5ac) a los 8 días.
✓ El estómago presentó un aumento de la tiopurina S-metiltransferasa (TPMT, por sus siglas en inglés) y del inhibidor de la elastasa leucocitaria B (SERPINB1) a los 15 días.
✓ Otros genes inmunitarios (profenoloxidasa [proPO], superóxido dismutasa [SOD] y lisozima [LYZ]) también se regularon al alza, en particular LYZ en las branquias (15 días).
Expresión diferencial de cirARN
✓ Branquias: 248 circARN.
✓ Estómago: 226 DEC.
✓ Los ARN parentales de los DEC estaban relacionados con la memoria inmunitaria, la respuesta al estrés y la unión a toxinas.
✓ La anotación de ontología genética (GO, por sus siglas en inglés) indicó que desempeñan funciones moleculares (unión hemo/ión), entrecruzamiento de péptidos y remodelación celular.
Validación de cirARN expresados diferencialmente (DEC) mediante qPCR
✓ DEC validadas: proteína similar a la molécula de adhesión celular del síndrome de Down (DSCAM), proteína de choque térmico 70 kDa “heat shock 70 kDa protein cognate 4-like” (HSP70), aminopeptidasa N (APN) y extensina (ETX).
✓ Los patrones de expresión génica de los ARN parentales coincidían en gran medida con los circARN, lo que confirma la modulación tras la suplementación con FD-LAB.
Inmunidad entrenada y resistencia a patógenos
Pruebas de desafío con V. parahaemolyticus (VPAHPND) y WSSV:
✓ La alimentación con FD-LAB durante 15 días aumentó significativamente la supervivencia de los camarones frente a ambos patógenos.
✓ La alimentación durante 8 días mejoró la supervivencia frente a VPAHPND, pero no frente a WSSV.
✓ La alimentación posterior a FD-LAB (7-14 días) mejoró la supervivencia, lo que indica la existencia de posibles mecanismos de inmunidad entrenados (Figura 2).
Discusión
FD-LAB mejora la inmunidad y la memoria inmunológica del camarón
La suplementación dietética con L. plantarum (FD-LAB) indujo cambios transcriptómicos significativos en P. vannamei, particularmente en genes relacionados con la inmunidad y la memoria inmunológica. El cultivo completo de FD-LAB contiene compuestos bioactivos que aumentan su potencial probiótico. El análisis del transcriptoma reveló la expresión diferencial de Muc5ac, un componente clave de la barrera mucosa, se reguló a la baja en las branquias, lo que podría influir en la resistencia a patógenos.
Las proteínas inmunitarias reguladoras, como SERPINB1, se regulan al alza, lo que sugiere su papel en la modulación inmunitaria y la inhibición bacteriana. El gen antibacteriano, factor anti-lipopolysaccharide (ALF, por sus siglas en inglés) también se reguló al alza, tanto en las branquias como en el estómago, contribuyendo a la resistencia bacteriana y viral.
Los genes relacionados con la memoria inmunitaria, como la tiopurina metiltransferasa (TPMT) y la histona H1-delta (HisH1), se expresaron de forma diferencial. La TPMT influye en la metilación del ADN, un mecanismo clave en la inmunidad entrenada, mientras que la HisH1 regula la expresión de genes inmunitarios y tiene propiedades antimicrobianas.
La regulación al alza de la ficolina-1 (FCN1), implicada en el reconocimiento de patógenos y la fagocitosis, sugiere una mejora de la respuesta inmunitaria. Estos cambios en los receptores de reconocimiento de patógenos (PRR, por sus siglas en inglés) indican un cebado inmunológico, una característica distintiva de la inmunidad entrenada.
Los cirARN actúan como reguladores inmunitarios
La suplementación con FD-LAB también moduló la expresión de los circARN, que desempeñan un papel crucial en la regulación inmunitaria. Algunos ejemplos notables son DSCAM, HSP70, EXT y APN.
La DSCAM está relacionada con la memoria inmunitaria y la inmunidad específica frente a patógenos, mientras que la HSP70 funciona como un patrón molecular asociado a daños (DAMP, por sus siglas en inglés) que activa las respuestas inmunitarias innatas. EXT y APN se expresaron de forma diferencial, contribuyendo posiblemente a las respuestas antimicrobianas y a la resistencia a la AHPND.
Los circARN dirigidos a genes de proteínas de la cutícula estaban regulados a la baja, lo que puede haber ayudado a inhibir la infección por WSSV, mientras que los relacionados con genes Rab estaban regulados al alza, en consonancia con informes anteriores sobre la resistencia al WSSV en camarones. Estos resultados sugieren que los circARN influyen en la regulación de genes relacionados con la inmunidad y contribuyen a la inmunidad entrenada.
Inmunidad entrenada y resistencia a patógenos
Las pruebas de desafío demuestran que la suplementación con FD-LAB mejoró la resistencia de los camarones al V. parahaemolyticus (VPAHPND) y al WSSV. Un periodo de alimentación de 15 días aumentó significativamente la supervivencia frente a ambos patógenos, mientras que un periodo de 8 días proporcionó protección frente al V. parahaemolyticus, pero no frente al WSSV.
Siete días después de la ingesta de FD-LAB, los camarones seguían mostrando mayores tasas de supervivencia frente a ambos patógenos, lo que sugiere que han desarrollado inmunidad entrenada. Sin embargo, después de 14 días, seguía habiendo protección contra el WSSV, pero no contra el VPAHPND, lo que indica la existencia de una memoria inmunitaria específica para cada estímulo.
Conclusión
La suplementación con FD-LAB mejora la inmunidad del camarón a través de la expresión diferencial de genes relacionados con la inmunidad y circARN. El cebado inmunológico inducido mejora el reconocimiento de patógenos, las respuestas antimicrobianas y la regulación epigenética, lo que convierte a FD-LAB en un prometedor aditivo funcional de los alimentos para la prevención de enfermedades en la acuicultura del camarón.
Esta es una versión resumida desarrollada por el equipo editorial de Panorama Acuícola Magazine del artículo “TRANSCRIPTOME ANALYSES OF MRNA AND CIRCULAR RNA REVEAL DIETARY SUPPLEMENTATION WITH FREEZE-DRIED LACTIPLANTIBACILLUS PLANTARUM PRIMES IMMUNE MEMORY OF WHITELEG SHRIMP (PENAEUS VANNAMEI) AGAINST PATHOGENS” escrito por DOMINGO GUZMAN, J. – Tokyo University of Marine Science and Technology and Industrial Technology Development Institute, NOZAKI, R.; KOIWAI, K., KONDO, H. and HIRONO I. – Tokyo University of Marine Science and Technology, AOKI, M; KUWAHARA, H. and MIKATA, K. – Sumitomo Chemicals Co., Ltd. La versión original, incluyendo tablas y figuras, fue publicada en DICIEMBRE de 2024 en FISH AND SHELLFISH IMMUNOLOGY. Se puede acceder a la versión completa a través de https://doi.org/10.1016/j.fsi.2024.110091
