Los mecanismos metabólicos de los efectos de probióticos, prebióticos y fibra dietética no son muy conocidos, por lo que la evaluación de productos inmunoestimulantes bajo un enfoque metabolómico resulta novedoso y demuestra su utilidad para revelar información valiosa acerca de estos en el cultivo de camarones Penaeus vannamei.
El camarón patiblanco, Penaeus vannamei, es la especie económicamente más valiosa, alcanzando en 2017 una producción de 4.45 toneladas métricas, valorada en 26.74 billones de USD. Junto con el aumento exponencial de la producción de camarones, surgen los brotes de enfermedades infecciosas, principal limitación que enfrenta la acuicultura de esta especie.
Los patógenos virales y bacterianos representan la mayor amenaza para la producción de camarones en el mundo.
“Una variedad de aplicaciones de antibióticos y otros tratamientos químicos han generado preocupación por sus impactos negativos.”
Por tanto, se requiere de enfoques más sostenibles, que aporten nuevas herramientas en la formulación de alimentos que pueda preparar mejor el sistema inmunológico del huésped contra los patógenos. Con este fin, la adición de diversos aditivos, incluidos prebióticos, probióticos y simbióticos, ha atraído recientemente el interés en la acuicultura del camarón.
A pesar del progreso significativo en los estudios de aditivos en la acuicultura, el proceso molecular que subyace a los mecanismos de su eficacia es poco claro y se requiere más investigación. En este sentido, la metabolómica, el estudio de pequeñas moléculas (metabolitos), es una herramienta innovadora de gran aplicabilidad para dilucidar este complejo mecanismo.
“La aplicación de la metabolómica en la acuicultura ha surgido en la última década y se aplica en campos como inmunología y enfermedades, estrés ambiental y ecotoxicología, poscosecha y optimización de la dieta.”
Para investigaciones sobre probióticos, prebióticos (o fibras de celulosa) y simbióticos en el cultivo de camarones, no se han reportado estudios de metabolómica basados en cromatografía de gases y espectrometría de masas (GC-MS, por sus siglas en inglés).
En el estudio que se presenta, se aplicó un enfoque metabólomico basado en GC-MS para comparar las respuestas metabólicas en hemolinfa y branquias de camarones patiblancos (P. vannamei) expuestos a diferentes tratamientos inmunoestimulantes (fibra de celulosa, probiótico con Vibrio alginolyticus y la combinación de fibra de celulosa y probióticos), y contribuir al desarrollo de tratamientos inmunoestimulantes eficientes en la acuicultura de camarón.
Materiales y métodos
Diseño experimental
El experimento se llevó a cabo en el Centro Nacional de Acuicultura e Investigaciones Marinas (CENAIM), Escuela Superior Politécnica del Litoral (ESPOL) en San Pedro, Ecuador.
Los camarones patiblancos (P. vannamei) (5.7 ± 0.6 g) fueron obtenidos en la estación experimental CENAIM (Provincia de Santa Elena, Ecuador) y se aclimataron en el laboratorio durante 5 días.
Luego, se transfirieron 10 camarones a cada uno de los tanques de tratamiento de 40 L, designados como control, fibra de celulosa, probiótico y mezcla de fibra vegetal y probiótico (ProFib) (Tabla 1).
Para los camarones en el tratamiento con fibra de celulosa, el alimento comercial (Skretting, 35% de proteína) se complementó con fibra de celulosa comercial (Sigmacell® Cellulose, Sigma-Aldrich, USA) a una concentración de 100 mg·kg-¹.
El probiótico V. alginolyticus (ILI) se administró por inmersión en agua hasta alcanzar una concentración final de 105 UCF·mL-¹ en los tratamientos de probióticos y fibra dietética.
“En el tercer tratamiento (ProFib), los camarones se cultivaron con una combinación de alimento complementado con fibra vegetal y agua enriquecida con probióticos.”
A los camarones del tanque de control solo se les suministró alimento comercial sin la adición de fibra de celulosa o probióticos. Todos los camarones, los de control y tratamientos, se alimentaron a 5% de su biomasa.
La cepa bacteriana probiótica V. alginolyticus (ILI) se empleó en el experimento para el tratamiento probiótico. Para ello, la cepa ILI se activó en placa de Petri con agar soya de tripticaseína y ClNa al 2% (TSA + ClNa al 2%).
Las placas se incubaron a 28°C por 24 h. Las colonias individuales se transfirieron a caldo LB (proporción de 4-5 colonias por cada 100 mL), y se incubaron a 28°C con movimiento constante (110 RPM) por 12 h.
Muestreo
Las condiciones experimentales se mantuvieron durante 5 días; luego, se tomaron muestras de 9 camarones de cada grupo de tratamiento y control para el análisis metabolómico. En primer lugar, se recogieron 200 μL de hemolinfa de cada organismo en crioviales de 2 mL y se colocaron inmediatamente en nitrógeno líquido.
Luego, los tejidos branquiales se cortaron y recolectaron en crioviales de 2 mL y se congelaron en nitrógeno líquido.
Análisis metabolómico
Los metabolitos de la hemolinfa (200 μL) y los tejidos branquiales (5 mg de tejido seco) se extrajeron con metanol acuoso frío (-20°C) y se trataron por derivatización con metil cloroformiato (MCF) con modificaciones menores.
Se añadió d4-alanina (20 μL de 10 mM) en cada muestra antes de la extracción como estándar interno. Las muestras en blanco que contenían solo 20 μL de alanina d4 10 mM se extrajeron junto con las muestras con fines de control de calidad (QC, por sus siglas en inglés).
Otro tipo de muestras de QC fueron las mezclas de aminoácidos (20 μL, 20 mM) que se derivatizaron como protocolo para las muestras. Posteriormente, se agruparon 10 μL de cada muestra para conformar una muestra de QC agrupada para cada tejido.
Las muestras derivatizadas se analizaron con un cromatógrafo de gases GC7890B acoplado a un espectrómetro de masas cuadrupolos MSD5977A (Agilent Technologies, CA, USA) con un detector de masa selectivo cuadrupolo (EI) operado a 70 eV.
Resultados
Perfil de metabolitos de hemolinfa y branquias
El Sistema Automatizado de Deconvolución e Identificación de Espectros de Masas (AMDIS, por sus siglas en inglés) arrojó en sus análisis 81 objetivos de 416 componentes tanto para la hemolinfa como para los tejidos branquiales.
Después de la marcación, hubo 84 y 81 metabolitos marcados para hemolinfas y tejidos branquiales, respectivamente. Estos compuestos pertenecen a categorías principales que incluyen aminoácidos, ácidos grasos, ácidos orgánicos y otros.
Respuesta metabólica de la hemolinfa a la nmunoestimulación
Los gráficos de puntuación de análisis de componentes principales (PCA, por sus siglas en inglés) mostraron una clara separación entre el tratamiento combinado y el control (Figura 1).
Sin embargo, no hubo separaciones claras entre el control y los tratamientos de celulosa de fibra y probióticos. Se observó cierto solapamiento en la distribución del tratamiento combinado de fibra de celulosa y probióticos.
De manera similar, el análisis discriminante (PLS-DA, por sus siglas en inglés) no mostró una buena discriminación entre el control y el tratamiento con fibra de celulosa, pero la separación entre el control y los probióticos fue más clara que en el gráfico de puntuación de PCA.
“La distribución del tratamiento combinado se diferenció claramente del control y la fibra de celulosa. Un análisis ANOVA unidireccional reveló 27 metabolitos que diferían entre estos grupos.”
Un mapa de calor de estos metabolitos muestra los detalles de estas diferencias (Figura 1), lo que indica que la mayoría de las diferencias entre los grupos, se relaciona con metabolitos elevados en el tratamiento combinado en comparación con el control.
Los probióticos mostraron niveles más altos de 5 metabolitos (metionina, ácido malónico, ácido 2-aninoadípico, triptófano y fenilalanina) y ligeros aumentos de otros 6 componentes (ácido mirístico, ácido palmitelaídico, dodecano, ácido cis-aconítico, alanina y ácido láctico) en comparación con el control.
De manera similar, el tratamiento con fibra de celulosa difirió del control con fuertes aumentos de 3 metabolitos (ácido itacónico, ácido levulínico y ácido dodecanoico) y ligeros aumentos de otros 6 compuestos (ácido margárico, ácido transvaccénico, heptadecano, ácido pentadecanoico, ácido mirírico y ácido palmitelaídico).
Se realizó un análisis de ruta solo entre los grupos combinado y control, ya que estos eran los únicos con una separación clara en los perfiles de metabolitos. Los resultados revelaron 34 vías involucradas en esta separación.
Después de filtrar (factor de impacto > 0, p ≤ 0.05, aciertos ≥ 2), solo 6 rutas se encontraron con alteraciones significativas debido al tratamiento combinado.
Respuestas metabólicas de las branquias a la inmunoestimulación
Los perfiles de metabolitos de los tejidos branquiales no mostraron una separación clara entre los tratamientos a través del gráfico de puntuación PCA, excepto por una ligera separación con cierto solapamiento entre el control y el grupo combinado (Figura 3A).
Cuando se realizó el análisis PLS-DA, hubo una ligera separación entre el grupo control y el combinado, así como entre el control y el probiótico, pero no entre el grupo combinado y el probiótico (Figura 3B). En forma similar, no se observó separación entre el grupo de fibra de celulosa y el control en el gráfico de puntuación PLS-DA.
De acuerdo con el análisis de conglomerados, el ANOVA unidireccional reveló que solo el ácido láctico era significativamente diferente entre los grupos (p < 0.05), el cual fue significativamente mayor en el tratamiento con probióticos que en los otros tratamientos (Figura 3C).
Análisis de la curva ROC de ácido itacónico y ácido láctico
El análisis univariante clásico de la curva de característica operativa del receptor (ROC, por sus siglas en inglés) reveló que el área bajo la curva del ácido itacónico en la hemolinfa y el ácido láctico, tanto en la hemolinfa como en el tejido branquial, tenía un valor alto de más de 0.91 (Figura 4).
Los resultados sugieren que el ácido itacónico y el ácido láctico podrían ser biomarcadores importantes y precisos para la clasificación y el modelado de predicción.
Discusión
Este estudio proporciona la primera investigación de metabolómica basada en GC-MS de inmunoestimulación de fibras de celulosa (fibra vegetal), probióticos, (V. alginolyticus) y un tratamiento combinado de fibra de celulosa y probióticos para camarones patiblancos (P. vannamei).
Las diferencias en los perfiles de metabolitos de la hemolinfa y tejidos branquiales del camarón revelaron efectos significativos de los tratamientos de las fibras de celulosas y probióticos en los camarones.
“Mientras que los perfiles de los metabolitos branquiales mostraron una diferencia significativa entre los tratamientos solo en ácido láctico, las hemolinfas revelaron alteraciones de 27 metabolitos.”
Los perfiles de metabolitos de la hemolinfa de los tratamientos individuales de fibra de celulosa y probióticos mostraron poca diferencia en comparación con el control, mientras que el tratamiento combinado mostró una diferencia notable en comparación con el control y los otros tratamientos con estimulantes individuales.
Esto sugiere que se puede lograr la mejor estimulación inmunológica con la aplicación combinada de fibra de celulosa y probióticos.
De acuerdo con este hallazgo, estudios previos en camarones también han demostrado que la combinación de fibra de celulosa y probióticos produce respuestas inmunes y supervivencia más altas de L. vannamei contra infecciones, en comparación con los tratamientos individuales con probióticos o prebióticos (Arisa, et.al., 2015 y Huynh, et al., 2018).
Conclusiones
Esta evaluación demuestra las bondades de la aplicación de la metabolómica para revelar información de respuestas metabólicas de camarones expuestos a diferentes productos inmunoestimulantes.
La combinación de fibras de celulosa como inmunoestimulante y V. alginolyticus como probióticos proporcionó una mejor estimulación que los tratamientos individuales y el control.
“Los resultados del estudio sugieren que la combinación de fibras de celulosa y probióticos podría usarse potencialmente en acuicultura para mejorar la salud y el crecimiento de los camarones de cultivo.”
Con este fin, es necesario realizar más experimentos para investigar los efectos a largo plazo de la aplicación de estos estimulantes sobre el crecimiento del camarón y las respuestas del huésped a los desafíos de patógenos.
Entre los metabolitos alterados, el ácido láctico aumentó tanto en la hemolinfa como en los tejidos branquiales en los camarones expuestos al tratamiento combinado, pero fue el único metabolito alterado en los tejidos branquiales del grupo de tratamiento con probióticos.
Esto sugiere que el ácido láctico puede ser un metabolito altamente sensible y potencialmente podría usarse como un biomarcador de estrés en la camaronicultura.
Esta es una versión resumida desarrollada por el equipo editorial Panorama Acuícola Magazine del artículo titulado “EVALUATION OF IMMUNE STIMULATORY PRODUCTS FOR WHITELEG SHRIMP (PENAEUS VANNAMEI) BY A METABOLOMICS APPROACH” escrito por ANDREA C. ALFARO – Auckland University of Technology, New Zealand; THAO V. NGUYEN Auckland University of Technology, New Zealand and NTT Hi-Tech Institute, Nguyen Tat Thanh University, Viet Nam; JENNY A. RODRÍGUEZ, BONNY BAYOT, CRISTOBAL, DOMÍNGUEZ BORBOR y STANISLAUS SONNENHOLZNER – Centro Nacional de Acuicultura e Investigaciones Marinas, CENAIM, Ecuador; AWANIS AZIZAN y LEONIE VENTER Auckland University of Technology, New Zealand.
La versión original, incluyendo tablas y figuras, fue publicada en DICIEMBRE de 2021 en FISH AND SHELLFISH IMMUNOLOGY.
Se puede acceder a la versión completa a través de https://doi.org/10.1016/j.fsi.2021.12.007
